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Roger Kornberg, left, the Nobel Laureate in Chemistry for 2006 pauses after a press conference to listen to his father Arthur Kornberg the 1959 Nobel Laureate in Medicine.

背景

Arthur Kornberg (1918-2007),1959年因在DNA合成方面的成就而获得Nobel 生理奖;他的大儿子,Roger Kornberg子承父业,因在RNA转录机理方面的研究获得2006年Nobel 化学奖。Arthur 一生研究超过30种酶, 被认为是酶学的一代宗师,其弟子中有两位Nobel laureates (Paul Berg/1980, Randy Schekman/2013), 他的自传自然不能被喜欢酶学的人所错过。

本书出版于1989年,当时生物化学发展出现颓势,很多学生认为酶学研究单调,对研究人员的实验技巧要求高。彼时分子生物学兴起,生物化学大有被分子生物学超越之势。作为酶学宗师,Arthur自然不甘生物化学的没落。”I have never met a dull enzyme. …Yet a current mood has developed that ignores or disparages enzymes…But attention to the enzymes that actually make and operate the cell has not kept pace. Without knowing and respecting enzymes, better still loving them, answeres to the most basic questions of growth, development, and disease will remain beyond reach”

这本自传一方面通过回忆自己的研究历程,总结经验以及对未来研究方向进行展望。这本书解决我长期以来的疑问:DNA double helix的提出(1953)仅比Arthur完成DNA合成(1956)早三年,Arthur体外合成DNA是否受了双螺旋理论的启发?如果不是,他如何在如此短时间完成如此艰巨的任务?Arthur告诉我们,他在40s年代开始研究核苷酸的合成途径,合成长链DNA只是水到渠成的事,DNA double helix的提出给了他将核苷酸连接起来的新任务(找到DNA polymerase)。

正文

Arthur开篇就对20世纪的生物学研究做了极为精当的总结,寥寥几句就让我有醍醐灌顶的感觉。aaf32342jw1ey5qk0ri5yj21b20wi7j0

Vitamin hunter

30年代的美国大学对犹太人还很歧视,招生率很低(和现在犹太人的地位不可同日而语),但Arthur还是凭借优异的成绩进入医学院,同时在J. of Clinical Investigation发表了一篇关于黄疸的论文, 并因此研究在1942年被NIH揽入。

Enzyme hunter

在NIH的初期

1930年代是维生素研究等黄金年代,但是Arthur敏锐地觉察到Vitamin的研究到了尽头,接下来就是阐述分子机理,也就是酶学方面的研究。

Biochemistry这一学科的产生源于人们对发酵机理的研究。法国是葡萄酒大国,人们数千年用葡萄酿酒,但是却不知道其中的奥秘。当时人们已知葡萄酒中主要碳源为sucrose,发酵后产物是ethanol和CO2,近代化学之父Lavoisier通过定量分析,证明发酵后碳源的减少和ethanol和CO2的增加一致,得出发酵反应的方程C6H12O6=2x C2H5OH+ 2x CO2,但是这个过程是如何实现的,这个问题要等到半世纪后的,由Louis Pasteur回答。当时人们认为葡萄酒发酵完全是自发进行的化学转化,微生物如酵母菌只是发酵的产物而非原因。但是人们无法在体外将糖溶液通过加热、加压或酸碱处理的方法转化为ethanol。Pasteur证实发酵是并非自然发生的,而是微生物参与的化学过程,但是Pasteur过于强调微生物的作用,让他忽略了发酵的化学本质:正是酵母菌体内的酶催化了糖转向ethanol这一过程。Modern Biochemistry源于1907年Nobel laureate,德国科学家Eduard Buchner的发现:将酵母破碎后,为了防止其腐败,Buchner加入大量的糖以抑制细菌生长,但是他发现很快容液中冒起了泡泡,后来他证实该过程就是发酵,细胞结构不是发酵的必要条件,他将催化发酵的物质命名为zymase(希腊语 zyme/leaven)。于是酶在生化反应中的重要作用被人们意识到,接下来的几十年人们开始鉴定很多具有重要生理功能的酶以及由众多酶组成的代谢途径。20时间40年代,通过德国科学家Otto Meyerhof等人的工作,无需氧气参与的糖酵解途径被成功解析,接下来的任务是更为复杂的有氧呼吸。

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Arthur在NIH从nutrition转向enzymology的第一个课题就是研究TCA cycle中succinate的氧化,其中涉及到succinate oxidase,该酶整合在线粒体内膜,将电子传递给FAD,是连接氧化磷酸化和电子传递的重要枢纽。关于这项研究加深了Arthur对ATP作为细胞energy currency的认识。要监测细胞/组织的氧化反应,最开始的方法是时刻分析产物的重量变化,方法非常繁琐。Warburg发明了manometer,通过测定气压变化用来分析细胞或组织的呼吸作用,该方法在30-40年代成为酶学实验室标配。但是到1941年,Beckman公司推出分光光度计后,虽然很贵($1,500,相当现在$45, 000),但因其简单,灵敏,易操作等优点迅速获得研究人员青睐。042016.001

Ochoa实验室和Cori实验室

Arthur于1945-1947在Ochoa实验室学习酶的提取和纯化,他研究的是TCA cycle中的aconitase,随后去Ochoa老师Cori实验室,当时就知道在肝脏代谢pyruvate时会积累焦磷酸,但是机理不明,Arthur对这个问题很感兴趣。Arthur发现氧化磷酸化会被NAD激活,其实是被NAD酶水解产物AMP激活(磷酸的供体)。当时人们专注可溶性蛋白却长期无法深入研究氧化磷酸化,直到后来lehninger发现氧化磷酸化发生在线粒体中,细胞破碎后很多酶系在膜上而非上清中,大家只关注可溶性蛋白故无法取得进展。Arthur当时果断放弃研究ATP来源,转向研究水解NAD的酶,他没有想到的是,这项研究会导致他研究辅酶的合成,发现焦磷酸的起源,甚至DNA的合成。

在NIH的黄金岁月(1948-1953)

Arthur鉴定的potato nucleotide pyrophsphatase,可以将NAD水解为AMP和NRP,利用这个酶,他确定了长期未定的NADP中phosphtate的位置。接下来他尝试是否能利用NRP反过来合成NAD。他发现yeast Lebedevsafts(酵母autolysis产物,含有丰富的酶,但没有水解NAD的酶,很关键的材料,否则会水解新合成的NAD)能催化反应:

NRP+ATP/Mg2+<—>NAD+PPi(这是首次合成辅酶!)

随后纯化了NAD synthetase; 接着一鼓作气他们鉴定了FAD synthetase和NADP synthetase,四篇重要的文章发表在1950年JBC,并为他赢得了annual award in enzymology。Arthur回忆自己的工作,虽然自己早期研究的是coenzyme小分子的生物合成,但是随着研究的深入,其实很多生物大分子的生物 (protein, lipid, carbohydrates, nucleic acid)合成机理和coenzyme类似, 都需要ATP/NTP活化并释放PPi:

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