事业巅峰,DNA Polymerase(Washington University, St. Louis)

早在1950,Arthur还在NIH时就对DNA的合成感兴趣,但是他首先需要制度nucleic acid的生物合成。彼时Buchanan和Greenberg利用同位素示踪技术解析了purine的生物合成,所以Arthur开始转向pyrimidine的合成。那时人们认为代谢途径应该是可逆的,化合物合成和降解只是方向不同而已。如果研究化合物生物合成,换位思维的话,通过研究其降解也能实现同样目的。于是他试图筛选降解pyrimidine的微生物,但是发现yeast不工作。后来他的博后Osamu Hayaishi从轮胎上刮了些泥土,发现培养后的微生物能够氧化pyrimidine为barbiturate。这个实验表明试图寻找pyrimidine降解产物来发现其合成原料不现实。因此他们将目标转向乳清酸/orotate (Greek’oro’/whey)。利用同位素标记orotate,结果证明其可以掺入核算之中。在Stanford University的微生物教授Barker的帮助下,筛选到厌氧条件下以orotate为碳/氮源的藻类。

1953年,Arthur出任WUSL微生物系的director,继续研究Orotate合成uracil。起初他用C14标记orotate环上的羧基,如果被转化为uracil,同位素读数应该降低。利用yeast或者liver提取液,发现orotate同位素读数有少量的降低。后来Arthur想到为何不把yeast和liver提取液混起来试试?结果出奇的好,同位素读数急剧降低,他猜测uracil合成需要多个酶参与该反应:liver中的酶活化磷酸核糖;yeast中的酶参与脱羧。二战后美国政府投大量资源造原子弹,诞生了一大批新的分析技术,其中就有chromatography。Arthur利用Dow chemical company的离子交换材料Dowex-1,分离鉴定一类全新的磷酸核糖PRPP (5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate,核糖上连接3个磷酸)。利用PRPP,他们鉴定了oeorix ribose-P脱羧酶,解析了AMP和UMP的合成。

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Arthur他们发现purine和pyrimidine的合成不同。Buchanan和Greenberg发现purine合成时,首先是PRPP的C-1和起始氨基酸反应,一步一步完成purine杂环的合成;而pyrimidine则不同,首先完成杂环的合成,然后再和PRPP羧和完成嘧啶单磷酸腺苷。

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既然已经弄清楚prurine和pyrimidine的合成,1953年,Arthur开始着手研究大分子核酸合成。虽然当时的人们认为这是个遥不可及的任务,但是Arthur从Cori夫妇体外成功合成glycogen中获得信心。研究化合物合成,一个难点在于将产物和反应物分离,但是核酸有个很好的特性:在酸性条件下会沉淀,因此很容易和可溶的反应物NTP/dNTP和ATP分离。他们开始想尝试RNA的合成,他们发现E. coli提取物能够让少量的同位素标记的ATP掺入到RNA中。但是1955年Herman Kalckar来到WUSL,告诉他们一个坏消息:Arthur博后老板Ochoa已经鉴定合成RNA的酶了(后来发现并不是RNA polymerase,而是Polynucleotide phosphorylase, Arthur反而失去鉴定RNA polymerase的机会)。Arthur他们马上转向DNA的合成。

他们最开始用同位素标记的thymidine,发现DNA合成效率很低,后来发现TTP效率比TDP,TMP效率高数倍,该方法完全可以鉴定DNA polymerase。有人说Arthur在DNA合成中加入template是受了2年前Watson-Crick的复制模型的影响。其实不是这样的,他其实是受了老师Coris用glycogen phosphorylase合成glycogen的影响:在glycogen合成中,需要一定的glycogen作为template以及prime。同时还有一个原因,加入外源的DNA可以减少同位素标记的DNA被核酸酶降解的机率。为了纯化E. coli的DNA polymerase, 他们请Iowa一家酿酒厂用10,000 gallon的发酵罐提供200磅的菌,花了一个月获得了0.5g的纯酶(,他分离的是DNA PolymeraseI,现在的条件只需2天就能从0.5磅的菌就能获得0.5g纯酶)。随后的实验表明合成DNA需要额外添加DNA以及dNTP。他们把相关结果整理为2篇JBC,没想到referees不同意发表,他们对合成的是多聚核苷酸还是遗传意义上的DNA有疑问。Arthur折腾烦了准备withdraw,巧合John Edsall马上要上任JBC的主编,他告诉Arthur,等他上任后就接受manuscripts。针对referees的疑问,Arthur他们分析了所合成的DNA的核酸组成,这篇发表在PNAS的文章合成的DNA的核酸构成和天然DNA无异。

接下来的岁月,Arthur证实了合成的DNA具有生物功能,以及研究DNA复制的机理。他大儿子Roger Kornberg子承父业,因在RNA转录机理方面的研究获得2006年Nobel 化学奖;小儿子Tom Kornberg从音乐转行生物,相继分离出DNA PolymeraseII以及III。学生中有DNA重组技术的先驱Paul Berg/1980,解析囊泡运输调节的Randy Schekman/2013,发现冈崎片段的Reiji Okazaki以及发现Ames致畸实验的Bruce Ames

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看完本书,我总结了Arthur成功的一些要素:

1. 努力:从一个医学生逐步成为一代酶学宗师;

2. 自知之明:知道自己化学,物理基础有待加强,随于1946年去Columbia University学习organic and physical chemistry);

3. 高效:在NIH建实验室的前四年几乎每天自己动手做实验。晚上回家一边照顾孩子一边构思次日的实验设计。

4. 不怕失败,biochemistry涉及到酶的分离纯化,面对未知性质的蛋白,需要自己摸索条件,当然需要好的物理,化学基础。

5. 好的研究策略:勇于尝试各种实验材料(potato, E. coli, bacillus, yeast),为我所用;先用混合物做实验,如果工作的话再分离出酶。

 PS:

2000年, 他在J Bacteriol总结了自己的关于酶学研究的十条经验,Ten Commandments: Lessons from the Enzymology of DNA Replication。很多观点现在看都很有参考价值。

>RELY ON ENZYMOLOGY TO CLARIFY BIOLOGIC QUESTIONS

>DO NOT WASTE CLEAN THINKING ON DIRTY ENZYMES

>DO NOT WASTE CLEAN ENZYMES ON DIRTY SUBSTRATES

>EMPLOY ENZYMES AS UNIQUE REAGENTS

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